Clonagem molecular, expressão, purificação e caracterização estrutural da endoglucanase de Trichoderma harzianum visando o desenvolvimento de coquetéis enzimáticos para a produção de etanol lignocelulósico

O aumento na demanda mundial por energia, a perspectiva de encolhimento dos recursos energéticos e a preocupação global com a questão ambiental, despertaram o interesse por fontes alternativas de energia. A biomassa lignocelulósica é abundante e de baixo custo, com potencial para complementar a produção em larga escala de combustíveis. A degradação das moléculas constituintes da parede celular à açúcares fermentescíveis e então à etanol, ocorre através da hidrólise enzimática da biomassa. Contudo, a utilização de enzimas para esse fim encontra-se em estágio exploratório e representa um gargalo na implementação de tecnologias de etanol 2G em escala industrial, desencadeando a busca de celulases bioquimicamente mais ativas, estáveis e economicamente viáveis. O presente trabalho visou a caracterização da endoglucanase I do fungo Trichoderma harzianum, e para isso foi realizada expressão, ensaios bioquímicos e biofísicos do domínio catalítico (ThCel7B-CCD) e da proteína inteira (ThCel7B-full). A enzima exibiu um perfil acidofílico, com atividade ótima em pH 3,0 a 55°C. A proteína também se mostrou capaz de hidrolisar uma variedade de substratos, sendo a maior atividade hidrolítica em β-glucano (75 U mg-1). Ao analisar a estabilidade térmica medida a 55°C em pH 5, a atividade residual manteve-se intacta por mais de 2 meses. Outra característica relevante foi o elevado grau de sinergismo entre ThCel7B e ThCel7A. Análises de microscopia eletrônica de flocos de aveia submetidas à hidrólise com ThCel7B evidenciaram os efeitos de degradação do substrato em relação às amostras controle. O conjunto desses resultados, além de importante para a compreensão do mecanismo molecular de ThCel7B e de outras endoglucanases da família GH7, também revelou uma enzima de interesse biotecnológicos uma vez que o comportamento ácido e sua estabilidade térmica são características relevantes para aplicações industriais sob condições extremamente ácidas.

Estudos de proteômica, estruturais e funcionais de proteínas envolvidas na degradação da biomassa lignocelulósica: expansinas microbianas e hidrolases de glicosídeos termofílicas

O Brasil possui uma posição privilegiada quando se refere à produção de etanol. Por questões históricas e geográficas o país é responsável por mais de 30 % da produção mundial de etanol, com uma produção nacional de mais de 28 bilhões de litros em 2014. Para maximizar o rendimento desse processo, está em desenvolvimento a tecnologia associada ao etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico. Os principais desafios desta tecnologia são: melhorar a eficiência de conversão do substrato em produto e a produção em grande escala utilizando substratos de baixo custo. Com o objetivo de melhorar a eficiência do processo de conversão foram estudadas proteínas auxiliares (expansinas) que, em conjunto com celulases, melhoram a despolimerização de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis. Além disso, realizou-se também a caracterização de enzimas ativas de carboidratos (CAZymes) de origem termofílica do organismo Thermogemmatispora sp. T81, devido a capacidade que estas proteínas apresentam de manter a atividade e conformação estrutural em altas temperaturas por um prolongado período de tempo. A partir de análises utilizando bioinformática, os genes que codificam para expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei foram clonados e expressos em E. coli, e seus produtos gênicos (as expansinas) tiveram seus índices de sinergismo (devido atuação conjunta com coquetéis comerciais) e atividade catalítica determinados. Adicionalmente, dispondo de alinhamentos estruturais, foi proposto um mecanismo hidrolítico para elas. Em relação à bactéria Thermogemmatispora sp. T81, foram realizadas análises genômicas e proteômicas, a fim de selecionar enzimas superexpressas em meio celulósico. Seus genes foram clonados heterologamente em E. coli e o produto de expressão caracterizado bioquimicamente (cromatografia, ensaios de atividade e perfil de hidrólise) e estruturalmente (SAXS e dicroísmo circular). Os índices de sinergismo determinados foram de 2,47; 1,96 e 2,44 para as expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei, respectivamente. A partir dos alinhamentos estruturais foi proposto a díade Asp/Glu como sitio catalítico em expansinas. As análises de proteômica possibilitaram a seleção de quatro alvos de clonagem, por apresentarem alto índice de expressão quando a bactéria foi cultivada em meio celulósico. Estas proteínas foram caracterizadas quanto a atividade e apresentaram um perfil comum: temperatura ótima de ação (de 70 a 75 °C), pH ótimo de 5, e hidrolisam preferencialmente substratos hemicelulósicos (xilano). A porcentagem de estruturais secundárias das proteínas em estudo foram confirmadas com predições teóricas ao se utilizar a técnica de dicroísmo circular. Desta maneira, os objetivos iniciais propostos neste projeto foram concluídos com a determinação do grau de sinergismo das proteínas expansinas em estudo e a proposição de um mecanismo de hidrólise para as mesmas, considerando que tais proteínas por mais de 20 anos tiveram sua atividade definida exclusivamente como acessória. Além disso, este estudo contribui com a identificação e seleção de genes para CAZymes termofilícas com aplicação biotecnológica devido às propriedades termoestáveis apresentadas.

Produção de hidrogênio por fermentação por um novo isolado de Clostridium beijerinckii

O hidrogênio (H2) tem sido considerado uma fonte de energia limpa bastante promissora, pois sua combustão origina apenas moléculas de água, sendo uma alternativa ao uso de combustíveis fósseis. Entretanto, os métodos atuais de produção de H2 demandam matérias-primas finitas e uma grande quantidade de energia, tornando a sua obtenção não sustentável. Mais recentemente, a via fermentativa tem sido considerada para a produção de H2, utilizando como matérias-primas efluentes industriais, materiais lignocelulósicos e biomassa de algas, denominado de bio-hidrogênio de primeira, segunda e terceira geração, respectivamente. Neste trabalho foi isolada uma bactéria anaeróbia a partir de uma cultura mista (lodo) de um sistema de tratamento de vinhaça, após pré-tratamento do lodo a pH 3 por 12 horas. Este microrganismo foi identificado com 99% de similaridade como Clostridium beijerinckii com base na sequência do gene RNAr 16S denominado de C. beijerinckii Br21. A temperatura e o pH mais adequados para o crescimento e produção de H2 por esta cultura foi 35 °C e pH inicial 7,0. A bactéria possui a capacidade de utilizar ampla variedade de fontes de carbono para a produção de H2 por fermentação, especialmente, monossacarídeos resultantes da hidrólise de biomassa de algas, tais como glicose, galactose e manose. Foram realizados ensaios em batelada para a produção de H2 com a bactéria isolada empregando diferentes concentrações de glicose e galactose, visando a sua futura utilização em hidrolisados de alga. Os parâmetros cinéticos dos ensaios de fermentação estimados pelo modelo de Gompertz modificado, como a velocidade máxima de produção (Rm), a quantidade máxima de hidrogênio produzido (Hmáx) e o tempo necessário para o início da produção de hidrogênio (fase lag) para a glicose (15 g/L) foram de: 58,27 mL de H2/h, 57,68 mmol de H2 e 8,29 h, respectivamente. Para a galactose (15 g/L), a Rm, Hmáx e foram de 67,64 mL de H2/h, 47,61 mmol de H2 e 17,22 horas, respectivamente. O principal metabólito detectado ao final dos ensaios de fermentação, foi o ácido butírico, seguido pelo ácido acético e o etanol, tanto para os ensaios com glicose, como com galactose. C. beijerinckii é um candidato bastante promissor para a produção de H2 por fermentação a partir de glicose e galactose e, consequentemente, a partir de biomassa de algas como substratos.